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Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 3781 (2022) Citar este artículo

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El patógeno fúngico oportunista Candida albicans normalmente es comensal y reside en la mucosa de la mayoría de los individuos sanos. En huéspedes susceptibles, su forma de hifas filamentosas puede invadir las capas epiteliales y provocar una infección sistémica superficial o grave. Aunque la invasión es principalmente intracelular, no causa daño aparente a las células huésped en las primeras etapas de la infección. Aquí, investigamos la invasión de C. albicans in vitro utilizando imágenes de células vivas y el reportero sensible al daño galectina-3. El análisis cuantitativo de células individuales muestra que la invasión puede provocar la ruptura de la membrana del huésped en diferentes etapas y la muerte de la célula huésped, o el paso de las células huésped sin ruptura de la membrana. El etiquetado de la membrana y la microscopía electrónica de "volumen" tridimensional revelan que las hifas pueden atravesar varias células huésped dentro de los túneles transcelulares que se remodelan progresivamente y pueden sufrir "inflaciones" vinculadas a las reservas de glucógeno del huésped. Por lo tanto, la invasión temprana de C. albicans de los tejidos epiteliales puede provocar la ruptura de la membrana del huésped o la formación de túneles transcelulares.

El hongo patógeno humano Candida albicans coloniza la mucosa oral, genital e intestinal de la mayoría de los individuos sanos y forma parte de la flora comensal normal1. C. albicans a menudo causa infecciones superficiales como la candidiasis oral o vaginal, y en huéspedes susceptibles puede invadir la mucosa gastrointestinal y entrar en el torrente sanguíneo, lo que lleva a una infección sistémica grave y potencialmente mortal2. C. albicans posee una variedad de rasgos de virulencia, lo que le permite colonizar dentro de la microbiota cuando es comensal e invadir los tejidos del huésped durante la infección. La capacidad de C. albicans para sufrir un cambio morfológico, pasando de células redondas de levadura a una forma de hifas filamentosas en respuesta a diversas señales ambientales, se considera su rasgo de virulencia más importante y se ha relacionado fuertemente con su capacidad para invadir y dañar. tejido huésped3,4.

La infección de las capas epiteliales procede a través de una serie de pasos secuenciales: fijación, inicio del crecimiento de las hifas, invasión y daño5. La unión a la superficie de la célula huésped está mediada por varias adhesinas, como Als3, que se une al receptor de E-cadherina en las células epiteliales, así como a Hwp1, Eap1 e Iff4, entre otras6,7,8.

Se cree que la invasión de C. albicans es principalmente un proceso intracelular (transcelular), al menos hasta el aflojamiento de las conexiones epiteliales y la ruptura de la barrera9,10,11,12, como lo indican los estudios de microscopía electrónica (EM) bidimensional y la tinción diferencial ensayos de invasión que sugieren que la invasión se origina predominantemente en la superficie apical de las células epiteliales5,10,13,14,15.

Si bien la invasión comienza alrededor de una o dos horas después de la unión, se ha informado que el daño de la célula huésped, medido por ensayos de liberación de LDH o 51Cr, ocurre en una etapa posterior, generalmente después de 6 a 24 h, dependiendo del tejido epitelial14,15,16, 17 De hecho, se cree que la principal causa de daño durante la infección epitelial por C. albicans no es la invasión en sí misma, sino otros factores como la candidiasis, una toxina peptídica fúngica secretada durante la infección18. Las células epiteliales infectadas por un mutante deficiente en la secreción de candidalisina siguen siendo invadidas normalmente, pero no sufren daño aparente11,18,19,20. Actualmente no se comprende bien cómo puede proceder la invasión intracelular de C. albicans sin dañar las células huésped21. Si bien la extensión de las hifas y la invaginación resultante de la membrana plasmática del huésped en el llamado "bolsillo de invasión" pueden explicar al menos una parte de la invasión intracelular, se espera una mayor extensión de las hifas dentro del huésped, y aún más en las células huésped vecinas. para conducir a una eventual ruptura y daño de la membrana del huésped debido al aumento del estiramiento de la membrana22,23. Los modelos actuales plantean la hipótesis de la presencia de una ruta de invasión intracelular no dañina, aunque no se ha descrito el mecanismo subyacente a dicha ruta11,20.

Se conocen dos mecanismos de invasión de C. albicans: endocitosis inducida y penetración activa20,24. La endocitosis inducida se considera un proceso "impulsado por el huésped", mediante el cual las invasinas expresadas en la superficie de las hifas de C. albicans inducen a las células huésped a producir seudópodos que engullen al patógeno y lo arrastran hacia el interior de la célula, un proceso análogo al mecanismo "disparador" empleado por varias bacterias invasoras como Shigella flexneri y Salmonella enterica serovar Typhimurium14,15,25,26,27. En las células epiteliales, las invasinas Als3 o Ssa1 activan una vía dependiente de clatrina mediada por E-cadherina, aunque también se ha sugerido una vía independiente de E-cadherina7,17,28,29,30. La penetración activa se considera un proceso "impulsado por hongos" que se basa en una combinación de fuerzas físicas ejercidas por la extensión de las hifas y factores fúngicos secretados como las aspartil proteinasas (Saps), aunque todavía existe relativamente poca información sobre este mecanismo31,32. Se ha informado que el inhibidor de la polimerización de actina, la citocalasina D, interrumpe la invasión por endocitosis inducida pero no por la penetración activa, lo que marca una distinción clave entre estos dos mecanismos14,27,30. Mientras que las células orales, vaginales y de micropliegues (M) son invadidas a través de ambos mecanismos, los enterocitos son invadidos solo a través de la penetración activa, aunque la razón subyacente de esta dependencia del tipo celular no está clara9,14,33,34,35. En el lado del huésped, la respuesta a la invasión sigue estando poco descrita, aunque se ha demostrado que la actina, la clatrina, la dinamina y la cortactina se reclutan en el sitio de la invasión y tienen un papel funcional en la internalización de C. albicans en las células HEK293 y JEG-329, 36. También se demostró que las pequeñas GTPasas Rac1, Cdc42 y Rho estaban co-localizadas con actina en el sitio de la invasión, aunque se desconoce su función precisa en este contexto37.

En general, los patógenos invasivos pueden emplear dos estrategias para ingresar a las células huésped: la ruptura de las membranas del huésped y la entrada al citosol del huésped o la residencia dentro de un compartimento unido a la membrana. Esta distinción entre "nichos" celulares ha sido especialmente útil para describir los estilos de vida intracelulares de bacterias invasoras que incluyen: patógenos que rompen la membrana como S. flexneri, Rickettsia spp. y Listeria monocytogenes; patógenos que residen en compartimentos unidos a membranas como Brucella spp., Legionella pneumophila y Chlamydia spp.; y patógenos que pueden adaptarse a ambos estilos de vida como S. enterica y Mycobacterium tuberculosis25,38,39,40. El hongo patógeno Cryptococcus neoformans reside dentro de un compartimento unido a la membrana en los macrófagos, donde puede inducir una expulsión no lítica a través de la fusión del fagosoma y las membranas plasmáticas41. Por el contrario, el estilo de vida invasivo de C. albicans aún no se comprende bien, con información limitada derivada principalmente de ensayos de punto final y EM bidimensional con respecto a los nichos celulares del huésped encontrados durante la invasión epitelial10,13,14,15,27. De hecho, actualmente no está claro si las membranas del huésped se rompen durante la invasión de C. albicans y cuándo; un aspecto clave para comprender el estilo de vida invasivo de este patógeno.

En este trabajo, investigamos el estilo de vida invasivo temprano de C. albicans durante la infección epitelial in vitro utilizando imágenes de células vivas combinadas con el reportero sensible al daño en tiempo real galectina-3. Proporcionamos una cuenta cuantitativa tanto en las células HeLa como en las Caco-2 de los eventos de ruptura de la membrana del huésped que ocurren en diferentes etapas de la invasión, lo que revela dos estilos de vida invasivos distintos: dañino y no dañino. Mediante el uso de microscopía electrónica de "volumen" tridimensional y el etiquetado de la membrana del huésped, demostramos que la invasión no dañina está mediada por túneles transcelulares derivados de la membrana del huésped que pueden extenderse a través de varias células del huésped y se remodelan progresivamente con cada célula invadida. celúla. Nuestro trabajo arroja luz sobre preguntas de larga data con respecto a la naturaleza precisa de la invasión y el daño del huésped durante las primeras etapas de la infección de las capas epiteliales por C. albicans.

Desarrollamos una nueva tubería experimental para estudiar los eventos de ruptura de la membrana durante la invasión de células epiteliales de C. albicans a nivel de una sola célula utilizando el reportero sensible al daño galectina-3 combinado con imágenes multidimensionales de células vivas y otros marcadores celulares. La galectina-3 es una pequeña proteína soluble localizada en el citosol, que tiene afinidad por los carbohidratos que contienen β-galactosa. Estos restos se encuentran típicamente en el lado luminal de las vesículas intracelulares y en la hoja externa de la membrana plasmática, pero no en el citosol ni en el núcleo42. Al expresar la galectina-3 vinculada a un indicador fluorescente, la ubicación precisa y el momento de los eventos de ruptura de la membrana lo suficientemente grandes como para permitir el reclutamiento de galectina se pueden rastrear en tiempo real, ya que al dañarse, la galectina-3 fluorescente fluye desde el citosol, a través de la membrana rota. y sobre la superficie celular, donde se une a restos que normalmente no tiene acceso42,43. La galectina-3 se ha utilizado para estudiar los estilos de vida de bacterias invasoras como S. flexneri y S. enterica39,42,44,45,46, así como el escape de C. albicans de los macrófagos47. En resumen, la tubería experimental consta de los siguientes pasos (ver Fig. 1A): (1) C. albicans se cultiva hasta la fase logarítmica y se diluye hasta una multiplicidad de infección (MOI) de 0,1. Paralelamente, las células epiteliales que expresan de forma estable eGFP-galectina-3 (de aquí en adelante denominada 'Gal-3') se cultivan hasta la confluencia. Se verificó que las líneas celulares utilizadas en este estudio no sobreexpresasen eGFP-galectina-3 en comparación con la galectina-3 endógena mediante transferencia Western e inmunoprecipitación (consulte la Fig. 1 complementaria). A continuación, las células huésped se tiñen con CellMask (CM), una tinción de membrana adecuada para la obtención de imágenes de células vivas que marca toda la membrana plasmática del huésped y el compartimento endocítico. Es importante destacar que la tinción de CM se realiza durante 10 minutos seguida de un lavado antes de agregar C. albicans, de modo que las membranas de C. albicans no estén marcadas por CM en ningún momento durante la tubería experimental.

Se presentan la tubería experimental (A) y los resultados para la invasión de HeLa (B). (A1) La invasión de C. albicans de células epiteliales que expresan de forma estable eGFP-Galectin-3 se estudia mediante imágenes de células vivas. Los reclutamientos de eGFP-Galectina-3 localizados de alta intensidad registrados son indicativos de daño en la membrana del huésped. (A2) Cada evento de invasión, definido como una sola interacción entre una hifa de C. albicans y una célula huésped a lo largo del tiempo, se subdivide en cinco etapas de invasión: antes del primer contacto con la membrana plasmática del huésped (BFC), primer contacto con el plasma del huésped membrana (FC), extensión de la hifa dentro del huésped (EH), segundo contacto con la membrana plasmática del huésped (SC), después del segundo contacto con la membrana plasmática del huésped (ASC). (A3) Para cada evento de invasión (X1, X2..), los reclutamientos de eGFP-Galectina-3 se asignan a la etapa en la que ocurrieron. (A4) Todos los eventos de invasión que comparten patrones comunes de reclutamiento de eGFP-Galectina-3 se agrupan en escenarios de invasión (S1, S2...). B Escenarios de invasión HeLa de C. albicans (n ​​= 629 eventos de invasión). Para cada escenario se presenta un evento de invasión representativo, dividido en las cinco etapas de invasión descritas en (A). Para cada etapa, se presenta una sola sección en canales de fase, Gal-3 y CellMask (CM), así como un recuadro (marco amarillo) que contiene una vista compuesta de los canales Gal-3 (verde) y CM (magenta). La muerte celular (si ocurrió) está marcada con una 'x' roja en la etapa de invasión correspondiente. La distribución del tiempo de muerte celular en función de la etapa de invasión se presenta para cada escenario. ND significa que no hay muerte celular durante la invasión. Las barras de escala tienen insertos de 10 µm o 5 µm. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

A continuación, se agrega C. albicans por encima de la capa epitelial, seguido de imágenes de células vivas de pilas z multicanal adquiridas cada 10 min durante 7 h.

(2) Posterior a la adquisición, cada evento de invasión, definido como una interacción entre una sola hifa de C. albicans y una sola célula huésped, se identifica y analiza individualmente. Cada evento se subdivide en cinco etapas de invasión: 1. Antes del primer contacto con la membrana plasmática del huésped (BFC), 2. Primer contacto con la membrana plasmática del huésped (FC), 3. Extensión dentro de la célula huésped (EH), 4 Segundo contacto con la membrana plasmática del huésped (SC), 5. Después del segundo contacto con la membrana plasmática del huésped (ASC).

(3) Los reclutamientos de Gal-3 observados se asignan a su etapa de invasión correspondiente.

(4) Todos los eventos de invasión que presentan patrones comunes de reclutamiento de Gal-3 dependientes de la etapa se agrupan en escenarios de invasión que representan las diferentes formas en que se manifiesta el daño de la membrana del huésped (o la falta del mismo) durante la invasión de C. albicans en una línea celular específica. Durante el análisis, los patrones de localización de CM y el tiempo de muerte de la célula huésped (determinado por la formación de ampollas en la membrana y los núcleos condensados ​​observados en contraste de fase o por tinción con yoduro de propidio48) también se registran y asignan a su etapa de invasión correspondiente para cada evento de invasión. Sin embargo, solo se usa la señal Gal-3 para definir los diferentes escenarios de invasión (para obtener detalles completos de la tubería, consulte Materiales y métodos).

En primer lugar, estudiamos la invasión de C. albicans en células HeLa (en adelante, HeLa) que expresan Gal-3, ya que esta línea celular no polar se ha utilizado previamente para caracterizar en detalle el daño de la membrana del huésped y los estilos de vida invasivos de S. flexneri. y S. enterica39,45. HeLa también se ha utilizado para estudiar la invasión de C. albicans, con la endocitosis inducida y la penetración activa implicadas como mecanismos de invasión26,29,30,49. La invasión de la cepa BWP17 (cepa WT)50 prototrófica de C. albicans de tipo salvaje en HeLa que expresa Gal-3 se estudió utilizando la tubería experimental descrita anteriormente. En general, estudiamos 629 eventos de invasión en seis experimentos estadísticamente comparables, en un período de tiempo de 0 a 7 h después de la infección.

El análisis de los eventos de invasión reveló cinco escenarios de invasión distintos (ver Fig. 1B, Películas complementarias 1–5): Escenario del 'sitio de entrada': Gal-3 se recluta en el sitio de contacto entre las hifas y la membrana plasmática del huésped durante FC (24 % de eventos); Escenario de 'múltiples sitios': Gal-3 se recluta en múltiples sitios durante FC y EH (10% de los eventos); Escenario del 'sitio de salida': Gal-3 se recluta en el segundo contacto con la membrana plasmática del huésped durante SC o ASC (15% de los eventos); Escenario 'asociado a la muerte celular': Gal-3 se recluta en un patrón alargado a lo largo de la trayectoria de la hifa. Este patrón de reclutamiento siempre coincidió con la muerte de la célula huésped, como lo revelan los datos de tiempo de muerte celular (ver detalles a continuación) (18% de los eventos); Escenario 'sin reclutamiento de Gal-3': no ​​se observa reclutamiento de Gal-3 durante la invasión (33% de los eventos). En general, observamos que los 'escenarios dañinos' que exhiben reclutamientos de Gal-3 constituyen el 67% de los eventos de invasión, y el escenario 'no dañino' 'sin reclutamiento de Gal-3' constituye el resto.

Calculamos el tiempo de recorrido de la célula huésped, definido como el tiempo que tarda una hifa en extenderse desde la etapa FC a la etapa SC, si no se produce la muerte de la célula huésped. En HeLa, el tiempo de recorrido tiene un promedio de 70 min ± 38 min independientemente del escenario de invasión, lo que sugiere que la ruptura de la membrana del huésped no afecta la dinámica general de la invasión (consulte la Fig. 2A complementaria). Para confirmar que los reclutamientos de Gal-3 se asociaron con hifas internalizadas que se extienden dentro de las células huésped, utilizamos un ensayo de tinción diferencial fijo adaptado de estudios de invasión anteriores 14,27 (consulte la Fig. 3 complementaria). Es de destacar que, si bien a menudo se observaron hifas invasoras que se extendían en las proximidades o junto a los núcleos de las células huésped, nunca se observó la invasión de C. albicans en el núcleo.

La distribución de muertes de células huésped en función de la etapa de invasión se calculó para cada escenario de invasión en función del contraste de fase como se describe anteriormente (ver Fig. 1B). Se consideró que la invasión había ocurrido sin muerte de la célula huésped si al menos 90 minutos después de la etapa SC no se observaba muerte de la célula huésped (anotada como ND en la Fig. 1B). Durante los "escenarios dañinos", se observó la muerte de las células huésped en el 92 % de los eventos, en comparación con el 41 % de los eventos en el escenario "sin reclutamiento de Gal-3". En el último escenario, solo el 13% de todos los eventos resultaron en muertes de células huésped durante las etapas FC, EH y SC, en comparación con el 65% de eventos que resultaron en muertes de células huésped en estas etapas en los "escenarios dañinos". El patrón de reclutamiento alargado de Gal-3 observado en el escenario 'asociado a la muerte celular' siempre coincidió con la muerte de la célula huésped, dentro de la resolución temporal del experimento. Este patrón de reclutamiento es probablemente el resultado de la permeabilización general de la membrana de la célula huésped que permite que Gal-3 se una a las membranas que rodean el camino de las hifas (ver más abajo). Para corroborar nuestras observaciones de la distribución de la muerte de la célula huésped, repetimos los experimentos de invasión de células HeLa en presencia del marcador de muerte celular yoduro de propidio (PI) (n = 358 eventos de invasión, consulte la Fig. 4 complementaria). La distribución de la muerte de la célula huésped dentro de los diferentes escenarios de invasión confirmó nuestras observaciones iniciales, con la muerte de la célula huésped observada durante los "escenarios dañinos" en el 94 % de los eventos, en comparación con el 69 % de los eventos en el escenario "sin reclutamiento de Gal-3". En el último escenario, solo el 26% de todos los eventos resultaron en muertes de células huésped durante las etapas FC, EH y SC, en comparación con el 61% de eventos que resultaron en muertes de células huésped en estas etapas en los "escenarios dañinos". El aumento general en la muerte de la célula huésped detectada usando PI puede deberse a una mejor identificación de la muerte de la célula huésped durante la obtención de imágenes de células vivas. En conjunto, la ruptura de la membrana del huésped durante la invasión de HeLa se asocia con mayor frecuencia con la muerte de la célula huésped, mientras que la invasión sin ruptura de la membrana del huésped se asocia con mayor frecuencia con la supervivencia de la célula huésped, particularmente durante el cruce de la célula huésped (etapas FC, EH, SC).

Como la mayoría de los estudios hasta ahora sobre el daño infligido durante la infección in vitro de C. albicans se han basado en la detección del daño a nivel de la población a través del ensayo de liberación de LDH, monitoreamos la liberación de LDH a las 3, 6 y 24 h después de la infección de HeLa (ver Complemento Tabla 1)11,14,15,16,30,32. Si bien la liberación de LDH no se detectó a las 6 h después de la infección con un MOI de 0,1 (utilizado en nuestra canalización de imágenes de células vivas), se detectó con un MOI de 1 en este momento. Esta diferencia probablemente se deba a la menor sensibilidad del ensayo de liberación de LDH para detectar daño celular en comparación con su detección a través de Gal-3 a nivel de una sola célula. A las 24 h después de la infección, se detectó daño celular en ambas MOI. En general, estos resultados son consistentes con nuestra observación del daño de la célula huésped infligido durante las primeras etapas de la infección de células HeLa.

El análisis de la membrana plasmática del huésped y el marcador del compartimento endocítico CM reveló un marcado uniforme tenue pero claro de las membranas de la célula huésped a lo largo del camino de la invasión durante los escenarios de "sitio de salida", "asociado a la muerte celular" y "sin reclutamiento de Gal-3". . Por el contrario, en el escenario del 'sitio de entrada', el etiquetado de CM se encontró solo en el sitio de ruptura de la membrana, y en el escenario de 'múltiples sitios', el etiquetado de CM estaba en forma de parches y puntos discontinuos a lo largo del camino de la invasión.

Finalmente, como la endocitosis inducida, pero no la penetración activa, es inhibida por el inhibidor de la polimerización de actina, la citocalasina D, examinamos el efecto del tratamiento con citocalasina D en la invasión de HeLa utilizando nuestra tubería experimental. El tratamiento con citocalasina D no alteró significativamente el número de eventos de invasión y la distribución de los escenarios de invasión de HeLa tampoco se alteró significativamente (ver la Fig. 5A complementaria). Este resultado sugiere que la invasión en este tipo de células no ocurre por endocitosis inducida según este criterio diferenciador, de acuerdo con datos publicados previamente51. Sin embargo, otro estudio en el que se controló directamente la endocitosis determinó un papel de la endocitosis en la invasión de HeLa29. Por lo tanto, como no monitoreamos directamente la endocitosis en nuestro estudio, no se puede excluir un papel de la endocitosis en la invasión en este tipo de células.

A continuación, utilizamos nuestra canalización experimental para estudiar en detalle la dinámica tridimensional del reclutamiento de CM. En un ejemplo sorprendente, una sola célula HeLa fue invadida por dos hifas, cada una a través de un escenario de invasión diferente (ver Fig. 2, Película complementaria 6). La invasión de la primera hifa (I) comenzó con un reclutamiento de Gal-3 durante la etapa FC, seguido de reclutamientos más pequeños de Gal-3 durante la etapa EH, lo que indica un escenario de invasión de 'sitios múltiples'. Alrededor de esta hifa, solo se observó un reclutamiento de CM discontinuo y localizado a lo largo del camino de invasión. La invasión de la segunda hifa (II) no desencadenó el reclutamiento de Gal-3 hasta la etapa ASC. Esta hifa estaba estrechamente rodeada por una etiqueta de CM continua durante toda la invasión. Durante la etapa SC, se observó una clara deformación hacia el exterior de la membrana plasmática del huésped, seguida de un reclutamiento de Gal-3 en forma de anillo durante la etapa ASC, lo que indica un escenario de invasión del "sitio de salida". Una vista transversal de la señal de CM a través de ambas hifas muestra la ausencia de CM alrededor de la hifa I y una organización circular de CM alrededor de la hifa II. Estos patrones de reclutamiento de CM fueron representativos de todos los escenarios de 'sitios múltiples' y 'sitio de salida' estudiados. En general, observamos que la organización de CM durante la invasión de HeLa depende del escenario de invasión, con una organización circular continua alrededor de las hifas invasoras en los escenarios 'sin reclutamiento de Gal-3', 'sitio de salida' y 'asociado a muerte celular', un y una organización discontinua a lo largo del camino de la invasión en el escenario de 'múltiples sitios', y un reclutamiento localizado en el sitio de ruptura de la membrana en el escenario del 'sitio de entrada' (ver la Fig. 6 complementaria). Curiosamente, en las regiones de muestra donde HeLa no era completamente confluente, a menudo observamos una etiqueta de CM continua que envolvía herméticamente las hifas de la etapa ASC que se extendía hacia el espacio entre las células, lo que sugería que las membranas del huésped se pueden estirar hacia afuera extendiendo las hifas después de la invasión (ver Fig. 7 complementaria) .

Se presentan seis puntos de tiempo, con las etapas de invasión definidas en la Fig. 1 correspondientes al filamento I (escenario de 'sitios múltiples') o II (escenario de 'sitio de salida'). Para cada punto de tiempo, se presenta una imagen de fase junto con una proyección de intensidad máxima de tres secciones z en los canales Gal-3 y CellMask (CM), y una imagen compuesta que muestra Gal-3 (verde) y CM (magenta) juntos. Se presentan dos recuadros (Gal-3 y CM) para cada punto de tiempo, correspondientes al filamento I o II. Se presenta una sección transversal en el canal CM a través de ambos filamentos (línea de puntos) en el punto de tiempo 70 min. Se observa una organización circular de CM alrededor del filamento II pero no del filamento I. No se observó muerte de células huésped durante el curso de la obtención de imágenes de células vivas. Las barras de escala son de 10 µm, 2 µm (recuadro) y 5 µm (sección transversal). Para otros escenarios de invasión, consulte la Fig. 6 complementaria.

La línea celular Caco-2 es un modelo ampliamente utilizado para enterocitos y es de particular relevancia para la invasión de C. albicans, ya que se considera que el intestino es el reservorio de infecciones sistémicas graves52,53. Varios estudios han indicado que la invasión de C. albicans en las células Caco-2 polarizadas (de ahora en adelante denominadas Caco-2) ocurre solo a través de la penetración activa9,14,34. No se detectó ningún daño en el huésped (medido por la liberación de LDH) en las primeras horas de la infección con Caco-2, a pesar de que ya se estaba produciendo una invasión extensa, lo que sugiere que la infección temprana en esta línea celular no es dañina11,14,16.

La invasión en el clon Caco-2 C2BBe1 que expresa Gal-3 de forma estable se estudió en 153 eventos de invasión en tres experimentos independientes, utilizando la misma tubería experimental descrita anteriormente, en un período de tiempo de 2 a 9 h después de la infección. La polarización de Caco-2 fue confirmada por la presencia de microvellosidades observadas por EM (ver más abajo)54. A diferencia de la invasión de HeLa, la invasión de Caco-2 se produjo a través de un escenario de invasión única en el que no se produjo ningún reclutamiento detectable de Gal-3 ni muerte de la célula huésped (detectada por contraste de fase) durante la obtención de imágenes de células vivas (ver Fig. 3A, Complementario). Película 7). En todos los eventos de invasión, se observó un marcado continuo de CM a lo largo de todo el camino de las hifas invasoras. Curiosamente, cuando se invadieron varias células huésped en secuencia, el etiquetado de CM parecía ser continuo, sin espacios detectables durante la transición entre las células (ver Fig. 3A, B, Película complementaria 8). Las vistas transversales revelaron una organización circular de CM alrededor de las hifas invasoras, que parecía idéntica al etiquetado de CM observado durante tres de los escenarios de invasión de HeLa ("sin reclutamiento de Gal-3", "sitio de salida" y "asociado a muerte celular"). Esta organización circular también podría detectarse en una vista frontal durante la invasión temprana cuando las hifas estaban casi alineadas a lo largo del eje z microscópico (ver Fig. 3C).

Un Caco-2 que expresa Gal-3 es invadido por un solo escenario de invasión sin reclutamiento de Gal-3 o muerte de la célula huésped. Se presenta una adquisición representativa de imágenes de células vivas de invasiones a través de dos celdas sucesivas (celda 1 y celda 2). Los seis puntos de tiempo corresponden a las etapas de invasión definidas en la Fig. 1. Se presentan los canales de fase (corte z único), Gal-3 y CM (proyección de intensidad máxima de siete cortes), junto con un recuadro (marco amarillo) para cada momento. punto. Los contornos de los dos Caco-2 invadidos y sus núcleos están resaltados con líneas amarillas discontinuas y punteadas respectivamente. El punto de entrada a la capa Caco-2 está marcado por una punta de flecha. B Representación tridimensional del etiquetado CM (magenta) presentado en (A) dentro de todo el volumen de adquisición en un solo punto de tiempo (350 min). Los contornos de las células epiteliales están en naranja. Se presentan una vista superior (XY) y una vista lateral (XZ) junto con las dimensiones del volumen. Las inserciones de canal C CM de dos puntos de tiempo de los datos presentados en (A) se presentan junto con vistas de sección transversal (CS) derivadas de las líneas discontinuas. D Imágenes de células vivas de la infección de Caco-2 que no expresa Gal-3 con una cepa de C. albicans que expresa GFPγ. Se presenta una proyección de intensidad media de cinco cortes. Se observa una 'inflación' transitoria local en el canal CM. Un recuadro (marco amarillo) que muestra una clara separación entre el etiquetado de CM y C. albicans cuando la 'inflación' está en su tamaño máximo se presenta en XY y en una sección transversal (CS) derivada de la línea de puntos. Como la hifa presentada se ha extendido desde una célula huésped previamente invadida, ya está completamente rodeada por el marcaje de CM en el tiempo 0 min. Las barras de escala son de 10 μm en (A, D), 5 μm en (A) recuadro, (C) vistas XY y (D) recuadro, y 2 μm en (C) vistas CS.

El tiempo de recorrido de la célula huésped durante la invasión de Caco-2 fue de 97 ± 54 min (ver la Fig. 2B complementaria) y la internalización de las hifas se confirmó mediante un ensayo de tinción diferencial fijo (ver la Fig. 3 complementaria). Como en HeLa, nunca se observó una invasión nuclear en Caco-2.

El daño y la muerte de la célula huésped durante la infección con Caco-2 se estudiaron más a fondo utilizando imágenes de células vivas de Caco-2 que expresan Gal-3 en presencia de PI temprano (2 a 9 h después de la infección) y tardío (19 a 29 h después de la infección) puntos de tiempo (ver la Fig. 8 complementaria). Si bien no se detectó reclutamiento de Gal-3 ni muerte de células huésped en puntos de tiempo tempranos, el reclutamiento de Gal-3 y la muerte de células huésped fueron abundantes en puntos de tiempo posteriores, lo que demuestra que la invasión no dañina en Caco-2 es un fenómeno de puntos de tiempo tempranos de infección. La ausencia de daño en el huésped en las primeras horas de la infección con Caco-2 se confirmó aún más a través del ensayo de liberación de LDH, en el que se detectó daño en el huésped a las 24 h después de la infección, pero no en los primeros momentos de la infección, de acuerdo con los datos publicados (ver Complementario Tabla 1)11,14,16.

En el 25 % de los eventos de invasión (n = 38/153) observamos una expansión localizada y transitoria del etiquetado de CM que rodea a las hifas invasoras. Para visualizar estas 'inflaciones' de membrana en detalle, realizamos experimentos de invasión en Caco-2 (sin expresar Gal-3), utilizando una cepa de C. albicans que expresa GFPγ en la membrana plasmática, lo que permite una distinción clara entre la señal de CM y la esquema de hifa (ver Fig. 3D, Película complementaria 9). Cada inflación se originó a partir del típico etiquetado de CM ajustado alrededor de las hifas extendidas, luego creció con el tiempo hasta que se detectó una clara separación entre la señal de CM y la hifa (ver Fig. 3D recuadro), seguido de un retorno a un etiquetado de CM ajustado alrededor de la hifa. hifa extendida. Se observaron inflaciones a lo largo de todo el camino de la invasión a través de Caco-2 y nunca se observaron durante la invasión de HeLa.

Finalmente, en cuanto a la invasión de HeLa, examinamos el efecto del tratamiento con citocalasina D en la invasión de Caco-2 utilizando nuestra tubería experimental (ver la Fig. 5B complementaria). Descubrimos que la invasión en Caco-2 tratado no cambió en relación con las células no tratadas y se produjo a través de un único escenario de invasión no dañino. El tratamiento no alteró significativamente el número de eventos de invasión, lo que sugiere que la invasión en este tipo de células no ocurre por endocitosis inducida según este criterio distintivo, de acuerdo con datos publicados previamente14.

Comprender con precisión cómo C. albicans invade las células huésped sin dañarlas requiere imágenes con una resolución más allá del límite de la microscopía de luz estándar. Además, el estudio de estructuras celulares que se extienden sobre largas distancias celulares e incluso varias células requiere imágenes tridimensionales a nanoescala de grandes volúmenes de muestra; una combinación difícil de obtener usando enfoques EM tradicionales55. Por lo tanto, estudiamos la invasión utilizando microscopía electrónica de barrido facial de bloque en serie (SBF-SEM), una técnica emergente de EM de "volumen" capaz de obtener imágenes de filamentos completos de C. albicans que invaden múltiples células huésped dentro de un único conjunto de datos 3D a una resolución de nanoescala56,57 ( ver figura 4). Como la invasión de Caco-2 se produce a través de un único escenario de invasión no dañino, nos dirigimos a esta línea celular para SBF-SEM. Caco-2 se infectaron con WT C. albicans durante 6 h, seguido de una preparación de muestras EM, lo que dio como resultado un excelente contraste de muestras tanto para las estructuras internas de C. albicans como el Spitzenkörper como para las membranas y orgánulos del huésped58 (consulte Materiales y métodos) . Las células huésped presentaron microvellosidades claras en su superficie apical, lo que indica polarización monocapa. Los conjuntos de datos se adquirieron en tres sesiones diferentes, con una resolución de 10 nm en el plano de adquisición y una resolución axial de 100 nm. En general, se adquirieron 11 volúmenes que contenían 11 sitios de invasión en los que se capturó la hifa invasora completa o casi completa y la secuencia de células huésped invadidas, y 30 sitios de invasión adicionales en los que solo se capturó un segmento parcial de una hifa invasora. Se presenta en detalle un conjunto de datos representativo que contiene un filamento de C. albicans que invade tres células huésped en sucesión (ver Fig. 4A, Película complementaria 10). En la Tabla complementaria 2 se puede encontrar una cuantificación de las características encontradas en los 11 volúmenes que contienen sitios de invasión completos o casi completos.

El volumen SBF-SEM representativo de AA se presenta junto con el tamaño y la resolución del conjunto de datos en cada eje (panel izquierdo). Una hifa de C. albicans en proceso de invasión se visualiza en tres dimensiones (blanco, panel central). Tres células huésped invadidas están codificadas por colores de acuerdo con la secuencia de invasión, celda 1 (magenta), celda 2 (verde), celda 3 (amarillo). Se anota la dirección de la extensión del filamento (flecha, panel derecho). B La organización de las membranas del huésped alrededor de la hifa se presenta para cada célula invadida con tres vistas transversales (Celda 1- a, b, c; Celda 2- d, e, f; Celda 3- g, h, i). Se anota la dirección de extensión del filamento (flecha). Los bordes entre las células se anotan según los colores en (A) y la hifa (Ca) y el núcleo huésped (Nuc) se anotan en (a). Se presenta un recuadro de la sección transversal central de cada celda con puntas de flecha que apuntan a las membranas huésped que rodean la hifa. La hifa en la celda 1 está fuertemente envuelta por una membrana delgada que a su vez está rodeada por una "capa de exclusión" (EL) desprovista de estructuras celulares (a, b, c, recuadro (b)). En la celda 2, se observa una membrana más gruesa que envuelve una luz estrecha y la hifa (d, e, f, recuadro (e)). En la celda 3, se observan dos membranas que rodean una luz estrecha y la hifa en (g, h, recuadro (h)). En (i) se observa una "inflación" que contiene múltiples vesículas. Se presenta una sección transversal de CA a través del eje largo de la hifa, que muestra las estructuras de membrana continua a lo largo de tres células (a, b). La "capa de exclusión" y las membranas que rodean la hifa se visualizan de acuerdo con la secuencia de células invadidas (c, d). Secuencia DA de cuatro secciones secuenciales que muestran el contacto directo entre la luz de "inflado" y los gránulos de glucógeno del huésped (a–d). Los gránulos de glucógeno se observan en (a). Una visualización presentada en la misma orientación que en (C) muestra el contacto entre la reserva de glucógeno del huésped (azul) y la "inflación" en la celda 3 (e). En (f) se presenta una vista girada 90 grados. Las barras de escala son de 5 µm en B, 1 µm en el recuadro B y 2 µm en D.

En todos los eventos de invasión examinados, las hifas invasoras estaban completamente envueltas por las membranas del huésped en todos los lados (excepto en los puntos de contacto con las reservas de glucógeno (ver más abajo)) de modo que las hifas siempre se encontraban dentro de una estructura de túnel continuo que podía extenderse a través de células huésped invadidas sucesivamente. Por el contrario, los filamentos no invasores observados en la superficie de la monocapa de Caco-2 no estaban asociados con ninguna membrana externa. Un examen cuidadoso de los datos reveló que la organización del túnel está vinculada a la secuencia en la que se invadieron las células huésped (ver Fig. 4B, Película complementaria 11). La invasión de la primera célula huésped en secuencia (célula 1) por un filamento que se originaba en la superficie de la monocapa de Caco-2 se caracterizó por un fuerte envolvimiento del filamento invasor por una única membrana huésped, que a su vez estaba rodeada por un ' capa de exclusión ', que no contenía compartimentos celulares u orgánulos del huésped (ver Fig. 4Ba, Bb y el recuadro (b)). Según trabajos publicados anteriormente que demuestran el reclutamiento de actina localizado en el sitio de la invasión de C. albicans en Caco-2, y estructuras similares compuestas de actina observadas durante la invasión de S. flexneri, esta "capa de exclusión" probablemente representa una región de enriquecimiento de actina14,46. La "capa de exclusión" se volvió progresivamente más delgada a medida que el filamento se extendía a través de la celda 1 y finalmente fue envuelta por la membrana plasmática al salir de la celda 1 (ver Fig. 4Bc). La invasión a la segunda célula huésped en la secuencia (célula 2) comenzó con el envolvimiento de las estructuras que rodean el filamento en la célula 1 por la membrana plasmática de la célula 2 (ver Fig. 4Bd), formando una estructura de membrana más gruesa y claramente visible que rodea el filamento. hifa más adentro de la celda 2 (ver Fig. 4Be y el recuadro (e)). Esta estructura de membrana persistió a lo largo de la celda 2 hasta la salida de la celda, donde tuvo lugar otro envolvimiento por la membrana plasmática de la celda 2 (ver Fig. 4Bf). La transición entre la celda 2 y la tercera celda en la secuencia (celda 3) pareció ocurrir de manera idéntica, con un envolvimiento de las estructuras de membrana visto en la celda 2 por la membrana plasmática de la celda 3, de modo que dos membranas gruesas claramente distinguibles. se podían observar capas (ver Fig. 4Bg, Bh y recuadro (h)). En conjunto, observamos una remodelación progresiva de la estructura del túnel que rodea los filamentos invasores que se produce en correspondencia con la secuencia de células invadidas (ver Fig. 4C, Película complementaria 12).

De acuerdo con nuestros experimentos de imágenes de células vivas, observamos 'inflaciones' locales de las membranas del huésped que rodean las hifas invasoras en cinco eventos de invasión de Caco-2 adquiridos por SBF-SEM (ver Fig. 4Bi, C, Tabla complementaria 2). En cuatro de los cinco inflados observados, el lumen de inflado contenía múltiples vesículas con un diámetro de alrededor de 200 nm que coincidía aproximadamente con el descrito para las vesículas extracelulares hifales (HEV) de C. albicans, aunque no se pudo determinar el origen de estas vesículas59. Sorprendentemente, en tres de las cinco inflaciones observadas, las reservas de glucógeno del huésped (previamente identificadas por EM en Caco-260) en las proximidades de la inflación parecían estar interrumpidas (en comparación con las tiendas que no estaban en las inmediaciones de las inflaciones) con algunos gránulos de glucógeno encontrados dentro de lo que parecía ser una abertura en las membranas del túnel y dentro del propio lumen de inflación. Esta abertura se encontró hacia el lado posterior (lejos de la punta de la hifa) de la inflación en los tres casos (ver Fig. 4D, Película complementaria 13, Tabla complementaria 2).

En el conjunto de datos presentado aquí, una parte de la inflación del túnel se encontró fuera de la célula huésped, aunque estaba directamente vinculada a través de un pasaje estrecho a la inflación intracelular. Los puntos de contacto entre las inflaciones del túnel y las reservas de glucógeno del huésped pueden representar puntos de absorción de nutrientes del huésped por parte de C. albicans (ver Discusión).

La cuantificación sistemática de la organización de las capas que rodean las hifas de C. albicans en relación con la secuencia de invasión mostró que en cada sitio de invasión analizado por SBF-SEM (n = 11), se reprodujo el mismo patrón (ver Tabla complementaria 2): un delgado membrana y una capa de exclusión en la celda 1, una membrana gruesa en la celda 2 y dos membranas gruesas en la celda 3. En un ejemplo sorprendente, SBF-SEM documentó cuatro células huésped invadidas en secuencia por una sola hifa (ver Fig. 5, Película complementaria 14). Las primeras tres células invadidas mostraron el patrón anterior, es decir, membrana delgada y capa de exclusión en la celda 1, membrana gruesa en la celda 2 y dos membranas gruesas en la celda 3. En la cuarta celda invadida, se observaron tres membranas gruesas alrededor de la hifa, que es consistente con la estructura acumulada en capas observada en las tres celdas previamente invadidas (ver Fig. 5, Representación esquemática). Por lo tanto, la adición progresiva de capas alrededor de las hifas invasoras correspondientes a la secuencia de invasión parece ser un sello distintivo de la invasión de Caco-2, siguiendo un patrón reproducible.

Los datos presentados se derivan de un volumen SBF-SEM que contiene un solo evento de invasión a través de cuatro células huésped en secuencia. Se presenta una sección representativa de cada célula huésped invadida en la secuencia de invasión junto con una representación esquemática que ilustra la organización de la capa de exclusión (EL) y la membrana huésped alrededor de la hifa en cada célula invadida. Las puntas de flecha indican las membranas observadas y su correspondiente representación esquemática. También se presenta una interpretación esquemática, correspondiente a la hipótesis de que las membranas del huésped se extienden desde cada célula invadida hacia la siguiente célula huésped en la secuencia de invasión, lo que da como resultado una acumulación progresiva de la capa de membrana. Los recuadros muestran en detalle la organización de la membrana inferida de acuerdo con esta hipótesis, con cada capa derivada de una membrana plasmática deformada con la entrada o salida de la hifa de cada célula invadida correspondiente. El conjunto de datos presentado corresponde al sitio de invasión 9 en la Tabla complementaria 2 y se presenta en la Película complementaria 14. La barra de escala es de 1 µm.

Una posible interpretación del origen de este patrón es que cada una de las capas gruesas que se observan alrededor de las hifas está compuesta de hecho por múltiples bicapas de membrana (ver Fig. 5, Interpretación esquemática). Como estas capas gruesas tienen un grosor similar al de la envoltura nuclear del huésped (ver Fig. 4Bf), es probable que estén compuestas por al menos dos bicapas de membrana. Sin embargo, los parámetros de adquisición utilizados en este estudio no permiten resolver múltiples bicapas dentro de las gruesas capas que rodean las hifas, como lo indica nuestra incapacidad para resolver la doble membrana de la envoltura nuclear del huésped. De acuerdo con esta interpretación, las múltiples bicapas que componen cada capa gruesa se derivan de la membrana plasmática de las células huésped previamente invadidas y de la célula actualmente invadida. Por ejemplo, la membrana gruesa observada en la celda 2 se derivaría de la membrana plasmática inicialmente deformada con la entrada de la hifa en la celda 1, una membrana adicional derivada de la membrana plasmática deformada con la salida de la hifa de la celda 1 y una tercera membrana derivada de la membrana plasmática deformada. tras la entrada de hifas en la celda 2. Hacemos hincapié en que esta es solo una interpretación posible de los datos observados, y que se requerirán enfoques de mayor resolución, así como estudios funcionales para demostrar esta opción u otras (ver Discusión).

Nuestro análisis de escenarios de invasión en células HeLa mostró que tanto la invasión dañina como la no dañina son posibles en esta línea celular, mientras que en las células Caco-2, la invasión siempre es no dañina en los primeros momentos de la infección. Usando CM para teñir las membranas del huésped que envuelven las hifas invasoras, mostramos que la invasión no dañina en ambos tipos de células siempre se caracteriza por hifas que atraviesan las células huésped dentro de los túneles transcelulares (TCT), en un proceso que denominamos 'C. albicans tunelización transcelular' (CaTCT). Los TCT también se observan claramente en dos de los escenarios dañinos en HeLa: 'sitio de salida' y 'asociado a la muerte celular' al menos hasta el punto de ruptura de la membrana o muerte de la célula huésped, lo que indica que en estos escenarios también se produce un túnel, aunque eventualmente resulta en daño. En el resto de los escenarios de invasión de HeLa, no se observaron TCT continuos (escenario de 'sitios múltiples') o no se pudieron discernir claramente (escenario de 'sitio de entrada'), lo que sugiere que algunos escenarios de invasión de HeLa pueden no estar asociados con TCT, aunque más se requiere investigación para abordar esta posibilidad. Por qué algunos eventos de invasión en HeLa dan como resultado CaTCT, mientras que otros dan como resultado daños, sigue siendo una pregunta abierta.

Encontramos que la ruptura de la membrana del huésped identificada a través del reclutamiento de Gal-3 durante la invasión de células HeLa coincide (dentro de la resolución temporal de nuestra configuración) o es seguida por la muerte de la célula huésped en la gran mayoría de los eventos de invasión estudiados. Por lo tanto, la ruptura de la membrana de este tipo es en gran medida "catastrófica" para las células huésped y, por lo tanto, no se repara con éxito en un grado que permita la supervivencia del huésped en la mayoría de los casos. Aún así, no se puede descartar un papel funcional para los mecanismos de reparación de la membrana del huésped durante la invasión, ya que estos podrían emplearse para reparar con éxito brechas de membrana demasiado pequeñas para ser detectadas por Gal-3, o brechas más grandes que no resultan en la muerte de la célula huésped. De hecho, se ha demostrado recientemente que los reporteros de galectina solo son sensibles para rastrear el daño "avanzado" de las endomembranas, y que el daño temprano o temporal no se puede rastrear con este reportero43. Además, un estudio reciente ha demostrado que las roturas de membrana inducidas por candidalisina en células TR146 durante las primeras horas de invasión pueden repararse mediante un mecanismo mediado por ESCRT61. Por lo tanto, las brechas inducidas por candidalisina que se reparan posteriormente probablemente sean demasiado pequeñas para ser detectadas por el reclutamiento de Gal-3, como se ha demostrado para las brechas formadas por la toxina bacteriana Listeriolisina O (LLO) producida por Listeria monocytogenes43. De hecho, como la acción de la candidalisina requiere la acumulación de toxinas dentro de la bolsa de invasión, es poco probable que el daño detectado durante el escenario de invasión del "sitio de entrada" sea causado por la candidalisina, ya que la bolsa de invasión apenas se forma en esta etapa22. Más bien, es probable que el daño detectado en este estudio, al menos en parte, sea el resultado de otros factores, como la tensión mecánica en la membrana plasmática del huésped causada por la extensión de las hifas. Recientemente se ha demostrado que el daño causado por la tensión mecánica durante la invasión puede repararse a través de la exocitosis del lisosoma, mediada por la maquinaria de autofagia del huésped y por el propio reclutamiento de galectina-3 51,61. En general, no podemos excluir la presencia de daños en la membrana del huésped no detectados por Gal-3, así como el papel de los mecanismos de reparación del huésped, durante los escenarios de invasión dañinos y no dañinos. Queda por explorar la naturaleza precisa del daño, así como el papel de los mecanismos de reparación del huésped durante la invasión.

La invasión tanto en HeLa como en Caco-2 no se vio alterada por el tratamiento con citocalasina D, un fármaco conocido por inhibir la invasión mediante endocitosis inducida. Por lo tanto, en nuestros modelos, CaTCT, así como la invasión dañina en HeLa, es distinta de la invasión por endocitosis inducida, al menos según este criterio distintivo. Este resultado es consistente con los estudios que sugieren que la endocitosis inducida no juega un papel importante en la invasión de HeLa y Caco-2, aunque la endocitosis se controló directamente en HeLa durante la invasión de C. albicans, donde se ha sugerido que ocurre a través de una E-cadherina. mecanismo independiente14,29,30,51. Si CaTCT es o no simplemente una penetración activa sigue siendo una pregunta abierta. Si bien el punto de vista actual sostiene que solo dos mecanismos (endocitosis inducida y penetración activa) impulsan la invasión epitelial intracelular de C. albicans, nuestro trabajo, realizado a nivel de una sola célula, ha revelado varios estilos de vida invasivos (CaTCT, invasión dañina asociada con TCT y daño invasión que puede no estar asociada con TCT) que pueden ser manifestaciones de un solo mecanismo de invasión o, alternativamente, pueden ser mecánicamente distintos entre sí a nivel molecular. Abordar esta pregunta requiere una investigación sistemática de los mecanismos moleculares del huésped y del hongo que subyacen en los escenarios de invasión dañina y CaTCT. También se requiere más trabajo para comprender la interfaz entre estos estilos de vida y la endocitosis inducida, realizada en modelos donde se sabe que ocurre la endocitosis inducida, como líneas de células epiteliales orales y vaginales o líneas de células endoteliales. En última instancia, el papel de CaTCT en la infección por C. albicans debe examinarse en modelos fisiológicamente más relevantes62.

CaTCT parece ser un proceso complejo, que implica una reorganización significativa de las membranas y los compartimentos del hospedador durante la extensión de las hifas que se produce sin que se rompa la membrana del hospedador, incluso cuando las hifas se extienden a través de múltiples células invadidas durante varias horas. En Caco-2, CaTCT caracteriza todos los eventos de invasión hasta al menos 9 h después de la infección. La ruptura de la membrana del huésped y la muerte celular se observan en puntos de tiempo posteriores (alrededor de 24 h después de la infección), de acuerdo con los estudios publicados11,14. Por lo tanto, CaTCT es un fenómeno de puntos de tiempo tempranos de infección, después de lo cual tiene lugar una transición hacia una invasión dañina. Es probable que esta última fase esté dominada por la acción de la candidalisina, ya que los mutantes de C. albicans que no expresan candidalisina no dañan las células huésped incluso en momentos posteriores, a pesar de su capacidad para invadir normalmente18.

Basado estrictamente en consideraciones estructurales derivadas de la microscopía de fluorescencia y SBF-SEM, proponemos que CaTCT procede a través de la siguiente secuencia de eventos (ver Fig. 6): la invasión en la primera célula huésped comienza con un envolvimiento apretado de la membrana plasmática del huésped alrededor del hifa extendida, que a su vez está envuelta por una capa de exclusión, probablemente derivada de la corteza de actina apical63 del huésped. Estas dos capas constituyen el TCT durante la invasión a través de la primera célula huésped en la secuencia de invasión (ver Fig. 6I). Salir de la primera célula y entrar en la segunda célula en la secuencia de invasión agrega dos membranas más a la estructura TCT, la primera derivada de la membrana plasmática de la primera célula al salir la hifa, y la segunda de la membrana plasmática de la segunda célula al entrar la hifa (ver Fig. .6II). Por lo tanto, dentro de la segunda célula huésped invadida, la TCT se compone de tres capas de membrana (dos que se extienden desde la primera célula invadida y una que se extiende desde la segunda célula invadida), quizás junto con restos de la capa de exclusión que se encuentra entre las dos membranas derivadas de la primera celda invadida. Esta secuencia se repite durante la invasión a la tercera célula en la secuencia de invasión, con el TCT compuesto por cinco capas de membrana durante la extensión de las hifas dentro de la tercera célula (ver Fig. 6III), y así sucesivamente, hasta que ocurre una transición a la invasión dañina. Alternativamente, la adición progresiva de capas de membrana a la estructura TCT dentro de cada célula huésped invadida en la secuencia de invasión podría deberse al reclutamiento de compartimentos internos del huésped (como ER o Golgi) o de membranas sintetizadas de novo dentro de cada célula invadida. Si bien no diferenciamos directamente entre estos dos modelos en nuestro estudio, encontramos que el último modelo es menos plausible, ya que requiere que cada célula huésped en la secuencia de invasión emplee diferentes patrones de reclutamiento o síntesis de membrana según su lugar en la secuencia de invasión. También es posible una combinación de ambos modelos, basándose en las contribuciones a la estructura de TCT tanto de la membrana plasmática de las células huésped previamente invadidas como del reclutamiento de las membranas internas. Se requieren enfoques de mayor resolución, ensayos funcionales que examinen directamente la transferencia de membranas de una célula huésped a otra dentro de la secuencia de invasión, así como estudios de los diferentes compartimentos endocíticos posiblemente implicados en la invasión para examinar más a fondo estos modelos propuestos. En general, CaTCT contrasta marcadamente con la propagación de célula a célula de bacterias invasoras móviles con actina como L. monocytogenes y S. flexneri que deben inducir la ruptura de la membrana del huésped seguida de un "escape" hacia el citosol del huésped en cada célula invadida antes de la transición a su vecino64.

Un modelo basado en la hipótesis de que las membranas del huésped se extienden desde cada célula invadida hasta la siguiente célula huésped en la secuencia de invasión, lo que da como resultado una acumulación progresiva de capas de membrana. Alternativamente, se pueden reclutar capas de membrana adicionales de los compartimentos endocíticos internos del huésped o se pueden formar de novo en cada célula invadida en correspondencia con la secuencia de invasión, aunque razonamos que estas son posibilidades menos probables (ver Discusión). Estos últimos modelos no se presentan. I La invasión de la primera célula en la secuencia de invasión (célula 1) se caracteriza por una fuerte envoltura de la membrana plasmática de la célula 1, así como una "capa de exclusión" (EL), que probablemente contiene actina derivada de la corteza de actina apical. II Al comienzo de la invasión en la segunda célula de la secuencia (célula 2), las estructuras que rodean la hifa en la célula 1, es decir, la membrana plasmática de la célula 1 (agregada durante la entrada de la célula 1) y otra membrana plasmática de la célula 1 (agregada durante la entrada de la célula 1). 1), están envueltos por la membrana plasmática de la celda 2. Es posible que partes de la capa de exclusión en la celda 1 también se extiendan hacia la estructura TCT (puntos grises). III La invasión en la celda 3 procede de manera similar, con las estructuras que rodean la hifa en la celda 2 envueltas por la membrana plasmática de la celda 3. Las vistas de corte transversal (derivadas de líneas punteadas) muestran las capas de membrana que rodean la pared celular de la hifa (negro ), con la capa de exclusión en gris oscuro, y cada capa de membrana coloreada según su célula de origen, es decir, magenta- celda 1, verde- celda 2, amarillo- celda 3. Capas de actina adicionales derivadas de actina cortical no apical también pueden estar presentes dentro de la estructura TCT, pero no se ilustraron para mayor claridad. El modelo presentado se aplica a la invasión no dañina y no tiene en cuenta los escenarios en los que se produce la ruptura de la membrana del huésped.

Sorprendentemente, se observó una capa de exclusión en la primera célula Caco-2 invadida en todos los conjuntos de datos SBF-SEM cuantificados. La reorganización y el reclutamiento de actina asociados con la invasión de C. albicans están bien documentados y se han identificado en diferentes tipos de células, incluida la Caco-214,36. En los datos publicados, el reclutamiento de actina se encuentra en o cerca del sitio de inserción de la hifa en la capa Caco-2, y no se observa más allá de las hifas insertadas dentro de la capa14. Se ha observado una capa de exclusión estructuralmente similar compuesta de actina durante las primeras etapas de la invasión de S. flexneri en las células epiteliales46,65. Estas observaciones se corresponden bien con el espesor de la capa de exclusión identificada en este estudio, que se encuentra dentro de la primera celda invadida. Si bien es probable que la capa de exclusión se derive de la corteza de actina apical del huésped hasta cierto punto, el mecanismo y los factores moleculares que subyacen a su formación y extensión en el huésped aún deben explorarse. Dado que CaTCT puede requerir un extenso estiramiento de la membrana plasmática del huésped sobre varias células huésped, la capa de exclusión podría proporcionar soporte estructural a la estructura de TCT, aunque se requiere más investigación para abordar esta posibilidad66,67. Es posible que los TCT inducidos por C. albicans compartan algunos rasgos comunes con los nanotubos de efecto túnel (TNT), definidos como canales membranosos abiertos entre células conectadas, que pueden estirarse hasta varios cientos de micras y contener actina en su interior68. De hecho, en este estudio se observaron estructuras similares a TNT que se extendían desde el HeLa invadido hacia la región entre las células.

Presumimos que las "inflaciones" de TCT que se encuentran en contacto directo con las reservas de glucógeno del huésped interrumpidas pueden representar sitios de absorción de nutrientes por parte de C. albicans durante CaTCT. Es probable que el acceso de C. albicans al citosol rico en nutrientes del huésped durante el CaTCT esté muy restringido debido a que las hifas están envueltas en TCT multicapa. Las reservas de glucógeno del huésped podrían proporcionar un sitio ideal para la absorción de nutrientes que C. albicans puede utilizar fácilmente, aunque se requiere más investigación para determinar el papel de las "inflaciones" de TCT en CaTCT69.

Como CaTCT ocurre sin contacto directo entre las hifas invasoras y el citosol del hospedador (con la exclusión de la interfase inflación-almacenamiento de glucógeno) y sin daño al hospedador, desde un punto de vista inmunológico, las células hospedadoras pueden percibir el CaTCT como un proceso enteramente extracelular. Por lo tanto, tanto el reconocimiento inmunitario innato de los patrones moleculares asociados al patógeno (PAMP) de C. albicans como la activación de los patrones moleculares asociados al daño epitelial (DAMP) pueden ser similares a los desencadenados por las hifas adherentes no invasoras de C. albicans23,70,71 ,72. Esta hipótesis está respaldada por un estudio que muestra que la infección de Caco-2 por C. albicans produce solo niveles bajos de respuestas de estrés celular del huésped y citocinas proinflamatorias durante las primeras horas de la infección16. En general, CaTCT puede representar un estilo de vida 'comensal-invasivo' que no daña las células huésped y limita las interacciones huésped-patógeno, por lo tanto, desencadena solo una respuesta inmune de bajo nivel.

La migración transcelular se ha descrito en el contexto de varios procesos sanos y patogénicos, incluida la diapédesis transcelular, en la que los leucocitos viajan a través de las células endoteliales para entrar o salir de los vasos sanguíneos, los esporozoítos de la malaria atraviesan los hepatocitos a través de vacuolas transitorias y la invasión por el hongo explosivo Magnaporthe grisea hifas en células de hojas de arroz73,74,75. Se ha informado que las hifas del patógeno fúngico Aspergillus fumigatus atraviesan el epitelio pulmonar humano sin alterar la integridad de la membrana del huésped utilizando un túnel sostenido por actina, lo que sugiere que la tunelización transcelular es quizás un rasgo común entre diferentes patógenos fúngicos76,77.

En conclusión, este estudio proporciona una visión detallada de los estilos de vida invasivos de C. albicans durante las primeras etapas de la infección de las células epiteliales, lo que implica la ruptura de la membrana del huésped o el cruce de la célula huésped sin dañarla. El mecanismo de tunelización transcelular descrito aquí arroja luz sobre cuestiones de larga data con respecto a la naturaleza precisa de la invasión de este patógeno fúngico.

C. albicans BWP17 cepa protótrofa de tipo salvaje (ura3Δ::λimm434/ura3Δ::λimm434 his1::hisG/HIS1::his1::hisG arg4::hisG/URA3::ARG4::arg4::hisG)78 o C Cepa BWP17 de . albicans que expresa GFPγ-CtRac1 en la membrana plasmática )79,80 (amablemente proporcionado por Robert Arkowitz, Universidad de Nice-Sophia Antipolis, Francia) en todos los ensayos como se indica. Las cepas se cultivaron rutinariamente en YPD líquido/agar (extracto de levadura al 1 %, peptona al 2 %, D-glucosa al 2 % con o sin agar al 2 %) suplementado con 80 µg/ml de uridina a 30 °C.

Patricia Latour Lambert (Instituto Pasteur, París, Francia) generó una línea celular HeLa que expresa de manera estable eGFP-galectina-3 (Gal-3) utilizando el kit de clonación TOPO direccional pLenti6/V5 (Invitrogen) con las secuencias codificantes de pEGFP- plásmido galectina-342,81. Todos los experimentos sobre HeLa se realizaron utilizando la línea celular HeLa-Gal-3. El subclon C2BBe1 de la línea celular Caco-2 que expresa de manera estable eGFP-galectina-3 (Gal-3) se generó como se describió previamente54. Las líneas celulares fueron proporcionadas amablemente por P. Latour Lambert y Jost Enninga (Instituto Pasteur, París, Francia). Caco-2 que no expresa Gal-3 se adquirió de Sigma (86010202). Todas las células se cultivaron de forma rutinaria en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco-Invitrogen) suplementado con suero bovino fetal al 10 % v/v (Gibco-Invitrogen) a 37 °C, CO2 al 5 %. Los experimentos de obtención de imágenes de células vivas se realizaron en medio EM ópticamente transparente (NaCl 120 mM, KCl 7 mM, CaCl2 1,8 mM, MgCl2 0,8 mM, glucosa 5 mM y Hepes 25 mM a pH 7,3)46 suplementado con 0,2 g/L de aminoácidos (MP Biomedicals SC Amino Acids Mix) y 80 µg/mL de uridina.

Para todos los experimentos, las células epiteliales se sembraron en placas µ-Plate 96 Well Black adecuadas para microscopía (Ibidi, Cat. 89626). 1,8-3,5 × 104 células HeLa se colocaron en placas 1 a 2 días antes de la infección y se infectaron con una confluencia del 90%. 1-1,5 × 104 células Caco-2 se colocaron en placas 6 a 7 días antes de la infección y se infectaron 24 horas después de alcanzar la confluencia53. La polarización de Caco-2 fue confirmada por la presencia de microvellosidades en la superficie apical observada por EM. Antes de la infección, las células huésped se lavaron dos veces con PBS. Para marcar la membrana plasmática de la célula huésped y el compartimento endocítico, se utilizó CellMask Deep Red Plasma Membrane Stain o CellMask Orange Plasma Membrane Stain (ThermoFisher) a una concentración de trabajo de 2,5 µg/ml. Las células epiteliales se incubaron en la oscuridad a 37 °C durante 10 minutos en medio EM y se lavaron una vez con PBS. Las células de C. albicans siempre se añadían después de la tinción y los lavados con CM epitelial y, por lo tanto, nunca estaban en contacto directo con esta tinción. Para los experimentos de inhibición de citocalasina, las células huésped se trataron con 0,5 µM de citocalasina D a 37 °C durante 45 min en medio EM y se lavaron una vez con PBS. Las cepas de C. albicans se cultivaron durante la noche en medio YPD líquido suplementado con 80 µg/mL de uridina a 30 °C, agitación de 200 rpm, seguido de una retrodilución a 1:100 en medio YPD fresco suplementado con 80 µg/mL de uridina y luego creció a fase exponencial a 30 °C, 200 rpm de agitación. Para evitar que las células de levadura se aglutinen, el cultivo se sometió a sonicación suave en hielo durante 6 ciclos de 15 segundos encendido y 30 segundos apagado 82, con un ajuste de potencia del 15 % utilizando el Fisherbrand Model 50 Sonic Dismembrator (Fisher Scientific) con un estándar de 1 micropunta de /8" de diámetro. Las células de levadura sonicadas se contaron con un hemocitómetro, se diluyeron en medio EM y se añadieron a las células epiteliales a una multiplicidad de infección (MOI) de 0,1 (7 × 103 células por pocillo), seguido de 15 min de incubación para permitir la adherencia inicial de las células de levadura a las células huésped. Para los experimentos de Caco-2, la imagen de células vivas se inició 2 horas después de la infección para maximizar la imagen de los eventos de invasión. Todos los experimentos de infección se realizaron en medio EM sin suero de ternero bovino fetal.

Las imágenes de células vivas se realizaron utilizando un microscopio AxioObserver de campo amplio invertido totalmente automatizado (Zeiss) equipado con iluminación LED Colibri 7 (Zeiss), una cámara Hamamatsu (ORCA-Flash4.0 V3), una etapa piezoeléctrica (Prior Scientific, NanoScanZ 100 ), una cámara ambiental con control de temperatura establecido en 37 °C y un dispositivo Definite Focus 2 (Zeiss) utilizado para contrarrestar la desviación del enfoque. Para las investigaciones iniciales de HeLa, se utilizó un objetivo de aire 40X (Plan-Neofluar NA 0.6) (ver Fig. 1). Para todos los demás experimentos de imágenes de células vivas, se utilizó un objetivo de inmersión en aceite 40X (Plan-Apochromat NA 1.4). Los datos se adquirieron utilizando el software ZEN 2.6 pro (Zeiss). Las películas se grabaron durante 7 h (de modo que el tiempo total posterior a la infección al final de la adquisición fue de 7 h para HeLa y de 9 h para Caco-2). Cada 10 minutos, se adquirió secuencialmente una pila z de 15 planos con pasos z de 0,94 µm (objetivo de aire 40X) o una pila z de 30 planos con pasos z de 0,37 µm (objetivo de aceite 40X) en dos canales fluorescentes, con un solo plano adquirido en fase. Gal-3 se excitó con un LED de 475 nm y se detectó con un filtro de 525 nm. El CellMask Orange Plasma Membrane Stain se excitó con un LED de 555 nm y se detectó con un filtro de 605 nm y el CellMask Deep Red Plasma Membrane Stain se excitó con un LED de 630 nm y se detectó con un filtro de 690 nm. La etapa BFC se definió como t = 0 min para cada evento de invasión presentado en las figuras.

Para la microscopía electrónica de barrido facial de bloque en serie (SBF-SEM), Caco-2 (que no expresa Gal-3) se infectó con la cepa de tipo salvaje C. albicans BWP17 durante 6 h en MOI 2, luego se fijó en PFA al 3%, 1 % de glutaraldehído durante 1 h a temperatura ambiente. Para aumentar la conductividad de la muestra en el microscopio, la monocapa celular se cubrió con una capa delgada de gelatina al 10 % que contenía 1 % de albúmina de suero bovino (BSA). Luego, las muestras se prepararon para SBF-SEM (protocolo NCMIR83) de la siguiente manera: las células se fijaron posteriormente durante 1 hora en una solución de osmio reducido que contenía tetróxido de osmio al 1 %, ferrocianuro de potasio al 1,5 % en PBS, seguido de incubación con tiocarbohidrazida al 1 % en PBS. agua durante 20 min. Posteriormente, las muestras se tiñeron con OsO4 al 2 % en agua durante 30 min, seguido de acetato de uranilo acuoso al 1 % a 4 °C durante la noche. A continuación, las monocapas celulares se sometieron a tinción con aspartato de plomo de Walton en bloque84 y se colocaron en un horno a 60 °C durante 30 min. Luego, las muestras se deshidrataron en concentraciones graduadas de etanol durante 10 min en cada paso. Las muestras se infiltraron con resina de baja viscosidad de agar al 30 % (Agar Scientific Ltd, Reino Unido) en etanol durante 1 hora, resina al 50 % durante 2 horas y resina al 100 % durante la noche. Luego se cambió la resina y las células se incubaron adicionalmente durante 3 h, antes de la inclusión en cápsulas invertidas y la polimerización durante 18 h a 60 °C. Los bloques polimerizados se montaron en trozos de aluminio para imágenes SBF (FEI Microtome 8 mm SEM Stub, Agar Scientific), con un kit de epoxi de plata de conducción de dos partes (EMS, 12642-14). Para obtener imágenes, las muestras en trozos de aluminio se recortaron con un ultramicrótomo y se insertaron en un TeneoVS SEM (ThermoFisher). Las adquisiciones se realizaron con una energía de haz de 3 kV, corriente de 200 pA, en modo LowVac a 40 Pa, un tiempo de permanencia de 1 µs por píxel a un tamaño de píxel de 10 nm. Se cortaron en serie secciones de 100 nm entre imágenes. En general, se adquirieron 11 conjuntos de datos diferentes, que contenían 11 eventos de invasión con hifas en su totalidad o casi en su totalidad dentro del volumen de adquisición, y 30 eventos de invasión que contenían hifas parcialmente dentro del volumen de adquisición.

Se lisaron células HeLa y Caco-2 que expresaban o no eGFP-galectina-3 durante 30 min en tampón RIPA (Tris-HCl 30 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 1 %, desoxicolato de sodio al 0,5 %, SDS, EDTA 1 mM), complementado con un cóctel de inhibidores de proteasa (Sigma-Aldrich). Después de eliminar el material insoluble por centrifugación a 12 000 g, los lisados ​​se mezclaron con un tampón de Laemmli concentrado o se incubaron durante 3 h a 4 °C con perlas GFP-Trap (Chromotek) para inmunoprecipitar eGFP-galectina-3. Las proteínas en los lisados ​​y los inmunoprecipitados se separaron mediante SDS-PAGE seguido de una transferencia a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF). La membrana se bloqueó en tampón salino tamponado con Tris que contenía albúmina sérica bovina al 5 % y Tween 20 al 0,1 % durante 1 hora a temperatura ambiente, antes de la incubación con combinaciones apropiadas de anticuerpos primarios y secundarios y la visualización con el sistema de imágenes Li-cor Odyssey. Los anticuerpos primarios utilizados fueron un mAb anti-galectina-3 de ratón (1:1000, sc-32790, Santa Cruz Biotechnology), un anti-GFP policlonal de conejo (1:2000, Proteintech) y un mAb anti-GAPDH de ratón (1: 2000, Proteintech). Los escaneos sin recortar y sin procesar de la transferencia se incluyen en el archivo de datos de origen.

HeLa que expresaba Gal-3 o Caco-2 que no expresaba Gal-3 se fijaron con PFA al 4 % durante 10 min a temperatura ambiente 4 h o 6 h después de la infección, respectivamente. Los Hela infectados se lavaron tres veces con PBS y las células fúngicas se marcaron primero con 10 µg/mL de concanavalina-A junto con tetrametilrodamina (Invitrogen) durante 20 minutos a temperatura ambiente, por lo que se etiquetaron las células fúngicas no invasivas y las partes externas de las células invasivas. células fúngicas como se describió previamente30. Para Caco-2 fijo, un anti-C de conejo. albicans anticuerpo policlonal a 2,5 µg/mL (OriGene) contrateñido con una IgG anti-conejo de cabra secundaria conjugada con Alexa Fluor 555 a 0,4 µg/mL (Invitrogen) como primera marca como se describió previamente14. Después de enjuagar tres veces con PBS, las células fúngicas se marcaron con 25 µg/mL de Remel BactiDrop Calcofluor White (ThermoFisher) durante 20 min a temperatura ambiente, marcando las células fúngicas no invasivas y las partes externas e internas de las células fúngicas invasivas como anteriormente. descrito14,30. Después de enjuagar 3 veces con PBS, las muestras fijadas se tomaron imágenes directamente bajo un microscopio invertido de campo amplio AxioObserver (Zeiss) con un objetivo de aceite 63X (Plan-Apochromat NA 1.4). El blanco de calcoflúor se excitó con un LED de 385 nm y la señal se detectó con un filtro de 480 nm. La concanavalina-A conjugada con tetrametilrodamina o el anticuerpo secundario se excitó con un LED de 555 nm y la señal se detectó con un filtro de 605 nm. Según el sitio de infección, se adquirió una pila z (rango total medio de 14 µm) con pasos z de 0,25 µm en cuatro canales, incluida la fase y tres canales fluorescentes (Gal-3, primera etiqueta, segunda etiqueta).

Se infectaron células HeLa o células Caco-2 con la cepa de tipo salvaje BWP17 de C. albicans a una MOI de 0,1 (7 × 103 células por pocillo) y una MOI de 1 (7 × 104 células por pocillo), como se describe anteriormente (consulte Procedimiento de infección). La liberación de LDH durante la infección se midió a las 3, 6 y 24 h después de la infección utilizando el kit de ensayo de citotoxicidad LDH CyQUANT™ (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Como controles, se midió la liberación de LDH en el medio circundante de capas epiteliales incubadas con medio de crecimiento solo (células de fondo) y de pocillos sin capas epiteliales pero sembrados con células de C. albicans en medio de crecimiento (C. albicans de fondo). Además, la liberación máxima de LDH de las células epiteliales se obtuvo mediante el tratamiento con Triton X-100 al 1 % en cada pocillo y rompiendo vigorosamente la capa epitelial con una punta de pipeta 1 h antes de cada punto de tiempo medido. El porcentaje de citotoxicidad de las células epiteliales infectadas con la cepa de tipo salvaje C. albicans BWP17 se calculó como se describió anteriormente14:

Todos los experimentos se realizaron por triplicado para cada condición y se repitieron tres veces. Los datos se presentan en la Tabla complementaria 1 como media ± desviación estándar (DE).

Antes de la infección, HeLa que expresaba Gal-3 o Caco-2 que expresaba Gal-3 se lavaron dos veces con PBS. Para marcar la membrana plasmática de la célula huésped y el compartimento endocítico, se utilizó CellMask Deep Red Plasma Membrane Stain (ThermoFisher) a una concentración de trabajo de 2,5 µg/ml. Las células epiteliales se incubaron en la oscuridad a 37 °C durante 10 min en medio EM y se lavaron una vez con PBS. Posteriormente, las células huésped se incubaron con yoduro de propidio (PI) (Invitrogen) a 500 µg/mL para HeLa que expresa Gal-3 o 2.5 mg/mL para Caco-2 que expresa Gal-3 en medio EM durante 10 min a temperatura ambiente. Después de eliminar la solución de yoduro de propidio, las células huésped se infectaron con la cepa de tipo salvaje C. albicans BWP17 a una MOI de 0,1 (7 × 103 células por pocillo) como se describe anteriormente (ver Procedimiento de infección). La obtención de imágenes se inició 15 min después de la infección para Hela con imágenes adquiridas cada 10 min durante 7 h. Para el estudio de puntos temporales tardíos de Caco-2, las imágenes se iniciaron a las 19 h después de la infección con imágenes adquiridas cada 10 min durante 10 h. Para los conjuntos de datos de invasión de células HeLa, se registró un número total de 358 eventos de invasión en cinco repeticiones independientes. Se utilizó la prueba Chi-cuadrado (χ2) para evaluar la homogeneidad en el tamaño de la distribución de los escenarios de invasión entre las cinco réplicas independientes, con un umbral de valor de p de 0,05 (valor de p = 0,025). Para cuantificar el tiempo de muerte de la célula huésped, la muerte celular se asignó a una etapa de invasión si ocurría dentro de los 30 minutos (tres cuadros) del inicio de esa etapa cuando se observó PI. Consideramos que las células huésped estaban vivas al final de la invasión si no se observaba la muerte de la célula huésped al menos 90 minutos después de la etapa SC. Las células huésped que estaban vivas después de SC pero que no se registraron durante 90 minutos adicionales debido al final de la sesión de imágenes en vivo se descartaron con el fin de cuantificar la muerte celular (se descartaron 98 eventos de invasión). En total, se utilizaron 260 eventos de invasión para la cuantificación de la muerte celular.

Los datos adquiridos por microscopía fluorescente se analizaron utilizando el software ZEN 2.6 pro (Zeiss, edición azul) y Fiji85. Los datos adquiridos por SBF-SEM se procesaron utilizando Fiji y Amira (ThermoFisher). La alineación de datos y la segmentación manual se realizaron con Amira. Las figuras se prepararon con Inkscape, con representación automática de imágenes en la Fig. 5 y representación pixelada de imágenes en todas las demás figuras.

Para los estudios de invasión de HeLa, se registró un número total de 629 eventos de invasión de seis réplicas independientes. Se utilizó la prueba Chi-cuadrado (χ2) para evaluar la homogeneidad en el tamaño de la distribución de los escenarios de invasión entre las seis réplicas independientes, con un umbral de valor de p de 0,05 (valor de p < 0,0001). Para los estudios de invasión de Caco-2, se registraron un total de 153 eventos de invasión en tres experimentos independientes. El tiempo de recorrido celular (CT) se definió como el tiempo necesario para que una hifa se extendiera a través de una célula huésped, que se calculó para cada evento de invasión de la siguiente manera: tiempo de CT = tiempo de SC - tiempo de FC. El tiempo de CT se calculó solo para las hifas que alcanzaron la etapa SC sin que ocurriera la muerte de la célula huésped. Para comparar el tiempo de CT entre cada uno de los cinco escenarios de invasión en HeLa, las diferencias estadísticas se evaluaron con una prueba estadística paramétrica, una prueba ANOVA de una vía (comparación de prueba t-Student múltiple) corregida adicionalmente con comparaciones múltiples de Tukey con umbral de valor p de 0,05. Para cuantificar el tiempo de muerte de la célula huésped, la muerte celular se asignó a una etapa de invasión si ocurría dentro de los 30 minutos (tres fotogramas) del inicio de esa etapa. Consideramos que las células huésped estaban vivas al final de la invasión si no se observaba la muerte de la célula huésped al menos 90 minutos después de la etapa SC. Las células huésped que estaban vivas después de SC pero que no se registraron durante 90 minutos adicionales debido al final de la sesión de imágenes en vivo se descartaron con el fin de cuantificar la muerte celular. Para los experimentos de tratamiento con citocalasina D, se utilizó una tubería experimental idéntica a la descrita anteriormente en tres experimentos independientes. Para HeLa infectada, se contó un número total de 618 eventos de invasión en cuatro repeticiones independientes (n = 311 para células no tratadas y n = 307 para células tratadas). La proporción de cada escenario de invasión se comparó entre células tratadas y no tratadas con una prueba estadística no paramétrica, una prueba U de Mann-Whitney, con un umbral de valor de p de 0,05 (valor de p = 0,2 para 'Sitio de entrada', valor de p = 0,6857 para 'Múltiples sitios', valor de p = 0,3428 para 'Sitio de salida', valor de p = 0,8857 para 'Muerte celular asociada', valor de p = 0,6857 para 'Sin reclutamiento de Gal-3'). Para Caco-2 infectado, se contó un número total de 261 eventos de invasión en tres réplicas independientes (n = 126 para células no tratadas y n = 135 para células tratadas). Como identificamos solo un único escenario de invasión, el número de eventos de invasión en las células tratadas se normalizó por el número de eventos de invasión en las células no tratadas y se comparó mediante una prueba estadística no paramétrica, la prueba de rango con signo de Wilcoxon, con un umbral de valor p de 0,05 (valor de p = 0,75). La diferencia en la distribución del escenario de invasión de HeLa en células tratadas con citocalasina D frente a células no tratadas se evaluó usando una prueba de χ2 para homogeneidad con un umbral de valor p de 0,05. Los errores se dan como desviación estándar si no se menciona lo contrario. El análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism 9.1.2. Número de veces que se repitieron los experimentos de forma independiente: Figs. 1: 6, 2: 3, 3A–C: 3, 3D: 3, 4: Las muestras se prepararon una vez para la adquisición SBF-SEM, seguidas de tres sesiones de adquisición diferentes. Figura 5: los datos presentados se adquirieron en las mismas sesiones utilizadas para la Fig. 4. Fig. 1 complementaria: transferencia repetida tres veces. Figs suplementarias. 2A: 6, 2B: 3, 3: 3, 4: 5, 5A: 4, 5B: 3, 6: 3, el mismo conjunto de datos utilizado para la Fig. 2. Fig. 7 complementaria: imagen representativa de las observaciones realizadas en los conjuntos de datos utilizados en la Fig. 1. Fig. 8 complementaria: 2. Tablas complementarias 1: 3 y 2: cuantificación de los datos presentados en las Figs. 4 y 5.

Se seleccionaron 11 conjuntos de datos SBF-SEM que contenían sitios de invasión completos o casi completos para la cuantificación. Los datos sin procesar se invirtieron y cada sitio de invasión se alineó en Fiji usando el complemento "Alineación de pila lineal con SIFT" usando el modo de traducción, seguido de un examen visual y registro de características cuantificadas. La resolución de todos los conjuntos de datos es 10 nm x, y y 100 nm en z. Todos los conjuntos de datos están disponibles en: https://doi.org/10.5281/zenodo.5776104.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los conjuntos de datos SBF-SEM generados en este estudio se han depositado en el repositorio de Zenodo con el identificador https://doi.org/10.5281/zenodo.5776104. Los conjuntos de datos de imágenes de células vivas producidos en este estudio están disponibles a pedido del autor correspondiente debido al tamaño de los datos y al formato multiparamétrico. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Descargar referencias

Agradecemos a R. Arkowitz y M. Bassilana (iBV, Niza, Francia) por proporcionarnos las cepas de C. albicans utilizadas en este estudio. Agradecemos a J. Enninga, PL Lambert y N. Mellouk (Institut Pasteur, París, Francia) por proporcionarnos líneas de células epiteliales de expresión estable y otros recursos. Agradecemos a C. D'Enfert y S. Bachellier-Bassi (Institut Pasteur, París, Francia) por su apoyo con herramientas experimentales. Agradecemos a M. Larsen y E. Rubinstein (Cimi-Paris, París, Francia) por su ayuda con el análisis estadístico y Western blot, respectivamente. Reconocemos la instalación central de ImagoSeine, miembro de la infraestructura France BioImaging respaldada por la subvención ANR-10-INBS-04 de la Agencia Nacional de Investigación de Francia. Este trabajo fue apoyado por el programa ATIP-Avenir para AW y por la beca Fondation pour la Recherche Médicale (FRM) (FDM202006011423) para AP.

Universidad de la Sorbona, Inserm, CNRS, Centro de Inmunología y Enfermedades Infecciosas, Cimi-Paris, 75013, París, Francia

Joy Lachat, Alice Pascault, Delphine Thibaut y Allon Weiner

Universidad de la Cité de París, CNRS, Instituto Jacques Monod, 75013, París, Francia

Rémi Le Borgne y Jean-Marc Verbavatz

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Conceptualización, AW; Metodología, AW, JL y JMV; Investigación, JL, AP, DT y RLB; Análisis Formal, JL y AW; Recursos, JMV; Redacción: borrador original, AW; Redacción: revisión y edición, AW, JL y JMV; Supervisión, AW

Correspondencia a Allon Weiner.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Damian Ekiert, Bernhard Hube y al otro revisor anónimo por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Lachat, J., Pascault, A., Thibaut, D. et al. Los túneles transcelulares inducidos por el hongo patógeno Candida albicans facilitan la invasión a través de sucesivas células epiteliales sin dañar al huésped. Nat Comun 13, 3781 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-31237-z

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Recibido: 16 Septiembre 2021

Aceptado: 09 junio 2022

Publicado: 30 junio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-31237-z

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